金属硫蛋白对糖尿病大鼠肾脏氧化应激的影响

张春阳，曲卫，石勇铨，邹俊杰，刘志民

(第二军医大学长征医院内分泌科，上海200003)

[摘要] 目的：观察抗氧化剂金属硫蛋白(metallothionein，MT)对糖尿病大鼠肾脏氧化应激指标及NADPH氧化酶的影响， 探讨MT对糖尿病大鼠肾脏保护作用的可能机制。方法：雄性SD大鼠随机分为正常对照组(NC，n=8)、糖尿病模型组(DM，n=7)以及糖尿病MT治疗组(DM+MT，n=8)，糖尿病大鼠腹腔注射链脲佐菌素(60mg/kg)制备糖尿病大鼠模型，DM+MT组大鼠给予10 g/kg体质量MT灌胃。4周后检测各组大鼠24 h尿蛋白(24 h UP)和肾质量/体质量(KW/BW)值，评价肾脏功能，比色法检测肾脏丙二醛(MDA)含量，real-time PCR法检测NADPH氧化酶亚基p47phox、p22phox，蛋白激酶C(PKC)-和血管紧张素原(Ang)mRNA表达。结果：与NC组相比，DM组24 h UP、KW/BW以及肾皮质MDA水平明显升高(P＜0.05)；肾皮质p47phox、p22phox、PKC—β和Ang mRNA表达显著升高(P＜0.05或P＜0.01)。与DM组相比，DM+MT组24 h UP、KW/BW以及肾皮质MDA水平降低(P＜0.05)，p47phox、PKC-β和Ang mRNA的表达水平降低(P＜0.05)，而p22phox无明显改变。结论：MT可能通过降低糖尿病大鼠肾脏氧化应激水平，抑制肾皮质PKC—β、Ang以及NADPH氧化酶亚基的表达，从而发挥肾脏保护作用。

[关键词] 金属硫蛋白；糖尿病肾病；NADPH氧化酶；蛋白激酶c；血管紧张素

[中图分类号] R 587．24   [文献标识码] A   [文章编号]0258—879X(2007)04—0389—04

Influence of metan0Uli0nein on kidney oxidation of diabetic rats

ZHANG Chun-yang，QU Wei，SHI Yong—quan，ZOU Jun-jie，LIU Zhi—min (Department of Endocrinology，Changzheng Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200003，China)

[ABSTRACT-]0bjective：To study the effect of metallothionein(MT)，a potent antioxidant，on the oxidative stress and NADPH oxidase in kidneys of diabetic rats．Methods．Male SD rats were assigned to the following 3 groups：normal control(NC，n=8)，diabetes mellitus control(DM，n=7)，diabetes mellitus models treated with MT by lavage(10 g·kg^-·d^-，DM+MT，n=8)．Diabetes in DM group and DM+MT group was induced by intraperitoneal injection of streptozotacin(60 mg/kg)．At 4 weeks after initiating treatment，24 h urinary protein(24 h UP)and kidney weight/body weight(KW/BW)were determined in the 3 groups to assess the renal function of rats； malondialdeyde(MDA) was examined with visible spectrophotometry；NADPH oxidase subunits p47phox and p22phox，protein kinase C(PKC)-β，and Angiotensinogen(Ang) were examined by real—time PCR．Results：MDA，24 h UP and KW/BW in DM group were significantly higher than those in NC group(P＜0．05)；expression of PKC-β，Ang，and NADPH oxidase subunits p22phox and p47phox mRNA were increased markedly in DM group compared with NC group(P＜0.05，P＜0.01)．24 h UP，KW/BW and MDA were significantly lower in DM+MT group compared with DM group(P＜0.05)；expression of p47phox，PKC-β and Ang mRNA were significantly decreased in DM+MT group compared with DM group(P<0.05)，BUT p mellitus．< diabetes with rats of kidney the on effect protective activity，excerting oxidase NADPH decrease kidney，and in Ang and PKC-β expression tissues，inhibit stress lower may changes．Conclusion：MT significant no had groups DM+MT DM mRNA p22phox>

[KEY WORDS-]metallothionein；diabetic nephropathies； NADPH oxidase；protein kinase C；angiotensinogen

[Acad J Sec Mil Med Univ，2007，28(4)：389—392-]

以往研究^[1-2]表明长期高血糖会导致糖尿病肾病(DN)的发生和发展，良好的血糖控制能减缓DN的进展，但无法最终抑制其发展。因此，有必要寻找防治DN的新措施。近年来，氧化应激在DN发病机制中的作用逐渐受到重视。动物实验^[3-4]表明糖尿病时氧化应激水平显著升高，抗氧化剂可以降低氧化应激水平，抑制DN的进展。但相关氧化剂的人体临床试验结果并不一致^[5]。因此，仍需进一步研究以筛选疗效确切的抗氧化剂。

金属硫蛋白(metallothionein，MT)是一种强抗氧化剂，可直接清除羟自由基(OH.^-)和O₂^-，发挥抗氧化作用 。有研究表明MT可能通过抑制NADPH氧化酶p47phox亚基表达，来发挥抗氧化作用，进而减轻糖尿病对心室肌收缩功能的损害。但具体机制仍不很清楚，因此，本研究观察了MT对糖尿病大鼠肾脏氧化应激指标及NADPH氧化酶的影响，进一步探讨MT对糖尿病大鼠肾脏保护作用的可能机制。

1材料和方法

1.1材料 链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司，MT由哈尔滨春源生物科技开发有限公司提供，丙二醛(MDA)测定试剂盒购自南京建成公司。血糖测定采用罗氏公司血糖测定仪。

1.2 动物分组及处理 雄性SD大鼠，体质量150~200 g，由上海实验动物中心提供。大鼠适应性饲养7 d后分组，设置正常对照组(NC)大鼠8只； 糖尿病组(DM)大鼠给予STZ(60 mg/kg)一次性腹腔注射，STZ用前以0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH 4．5)新鲜配制，1周后尾静脉采血测定血糖，以血糖大于16.7 mmol/L确定为糖尿病模型，再随机分为2组：糖尿病模型组(DM)7只和糖尿病MT治疗组(DM+MT)8只。MT蛋粉和MT奶粉按7：3比例，以最大浓度制备成混悬液，相当于1 g MT蛋奶粉/2 ml，DM+MT组大鼠按每天10 g/kg体质量灌胃；NC和DM组大鼠予等量的生理盐水溶液灌胃。所有大鼠自由饮水，给予正常大鼠饲料，每周测量体质量和血糖。

持续给药4周后用代谢笼留24 h尿液，测尿蛋白排泄量(24 h UP)。实验动物空腹麻醉下迅速取出肾脏，称右肾质量，计算肾质量/体质量(KW/BW)，分离肾皮质，-70℃低温冰箱保存，用于检测丙二醛(MDA)、NADPH氧化酶亚基p22phox和p47phox、蛋白激酶C(PKC)-β及血管紧张素原(Ang)mRNA。

1.3 肾皮质MDA含量的测定 按照MDA试剂盒说明书操作，用比色法测定。

1.4 Real—time PCR法检测肾组织PKC—β、Ang及NADPH氧化酶亚基p22phox、p47phox mRNA的表达 Ang是Ang—I1的前体，故本研究检测Ang mRNA的表达水平来间接了解肾脏组织内Ang Ⅱ的表达；为了更准确地反映待测指标mRNA表达水平在各组间的相对差异，本研究采用18 S核糖体亚基mRNA为参照，即取待测mRNA/18 S mRNA比值，消除标本量对结果的影响。

1.4.1 总RNA提取 取出冰冻100 mg肾皮质，用TRIzol提取总RNA，电泳观察RNA的浓度和完整性。

1.4.2 引物 根据GenBank提供的大鼠p22phox(NM-024160)、p47phox(NM-053734)、Ang(NM-134432)、PKC-β(NM-012713)mRNA序列，利用 Primer Premier 5.0，自行设计引物。p22phox：上游引物5^’-CGG GCT GTC CTC CAC TTA CTG C-3^’，下游引物5^’-TGA TGG TGC CTC CAA CCT GCG-3^’；p47phox：上游引物5^’-GGA CAC CTA TCG CCG CAA CAG-3^’，下游引物5^’-GAT GAG GTC CGA GCT GGG TCT C-3^’；Ang：上游引物5^’-TTG TCT GGG CTG GAG CTA AAG G-3^’，下游引物5^’-GCA GGT GCT CTT GCT GTA GTA G-3^’；PKC-β：上游引物5^’-GGG CTT CGG GAA ACA GGG ATT C-3^’，下游引物5^’-TGG TCA CAG AAG GTA GGG CTG G-3^’。引物由上海欧易生物科技有限公司合成。

1.4.3 RNA样品逆转录 利用RNA逆转录试剂 盒进行RNA逆转录。试剂盒使用TaKaRa公司的 RNA PCR kit，按照试剂盒提供的反应体系进行反转录反应。

1.4.4 Real—time PCR 利用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)kit进行 real—time PCR反应。PCR仪使用Corbet Research 公司Rotor—Gene3000。实验结果利用软件Rotor—Gene 5.0以及Excel 7.0进行数据分析处理。

1.4.5 标准曲线的绘制 将预试验的PCR产物按照10倍浓度梯度进行稀释，选择 1/1 000，1/10 000，1/100 000，1/1 000 000浓度的稀释产物作为标准品模板，进行real—time PCR反应。通过这4个标准品生成的反应数据，应用软件Rotor—Gene 6.0根据反应的荧光实时监控数据和标准品的浓度关系，生成标准曲线。

1.5统计学处理 采用SPSS 12.0统计软件，实验数据用 x±S表示，各组间数据差异显著性均采用t 检验处理。

2 结 果

2.1 糖尿病模型的制备情况 与NC组相比，DM 组和DM+MT大鼠血糖水平显著升高(P＜0.01)，体质量明显减轻(P＜0.05)；与DM组相比，DM+ MT组大鼠血糖和体质量没有明显改变，差异无统计学意义(表1)。

2.2 各组大鼠肾功能及MDA检测结果 如表1 所示，与NC组相比，DM组KW/BW、24 h UP和。肾皮质MDA水平均显著升高(P＜0.05或0.01)。与 DM组相比较，DM+MT组大鼠KW/BW、24 h UP和。肾皮质MDA水平显著降低(P＜0.05)。

表1各组大鼠血糖、体质量、肾质量/体质量、尿蛋白和MDA检测结果

Tab l Blood glucose。weight。KW／BW。24 h UP and MDA levels in each group

2.3 Real—time PCR检测结果

2.3.1 NADPH氧化酶亚基的表达 与NC组相比，DM+MT组和DM组p22phox mRNA表达显著升高(P＜0.05)，DM+MT组。肾皮质p22phox mRNA水平与DM组相比无显著差异。DM+MT 组和DM组大鼠p47phox mRNA表达水平较NC组大鼠均显著升高(P＜0.05)，DM+MT组 p47phox mRNA水平较DM组降(P＜0.05)。详见图1A。

2.3.2 PKC-β和Ang水平 与NC组相比，DM+ MT组和DM组PKC-β和Ang mRNA表达水平显著升高(P＜0.01)；DM+MT组大鼠PKC-β和Ang mRNA水平较DM组显著降低(P＜0.05)。详见图 1B、1C

图1 各组大鼠肾组织NADPH氧化酶亚基(A)、Ang(B)以及PKC-β(C)mRNA的表达

Fig l Expression of p22phox and p47phox(A)。angiotensinogen(B) and PKC-β(C)mRNA as detected by real time PCR The levels of p22phox and p47phox，angiotensin0gen and PKCQ3 mRNA were relative to 18 s rRNA．Results were expressed relative to NC group，which were arbitrarily assigned a value of 1．0． P＜0.05 V5 NC group； P＜0.05 VS DM group;x±s

3 讨 论

糖尿病肾病的早期表现是。肾脏肥大，质量增加，尿蛋白水平升高。故KW/BW和24 h UP可反映糖尿病大鼠。肾脏的早期病变情况，本研究表明，MT 可使糖尿病大鼠这两项指标明显下降，减轻高血糖对肾脏的损伤，抑制糖尿病大鼠早期。肾脏病变的进展。糖尿病时氧化应激水平显著升高，NADPH氧化酶是糖尿病时高水平活性氧族(ROS)的重要来源之一^[3]。为了评价MT对糖尿病大鼠肾脏氧化应激水平的影响，本研究检测了肾皮质MDA水平，结果表明，MT可部分抑制糖尿病大鼠肾脏MDA的水平。降低糖尿病大鼠。肾脏氧化应激水平，减少ROS的产生和对肾组织的损伤。

糖尿病时NADPH氧化酶处于活化状态，而抑制其活性可以降低糖尿病大鼠肾脏氧化应激水平，抑制。肾小球基质沉积，减少尿蛋白，减缓DN的进展^[9]。因此，NADPH氧化酶是防治DN的一个重要靶点，包括多个亚基，其中p22phox位于细胞膜上，p47phox在细胞质内。p47phox磷酸化后可转位到细胞膜，与p22phox结合使该酶具有催化活性^[10]。在肾脏系膜细胞中有p22phox和p47phox表达。高血糖时肾脏PKC-β和Ang-Ⅱ活性增强，是引起DN的重要因素，也促进p47phox表达和转位，增强NADPH氧化酶活性的作用^[11-12]。

本研究结果表明，MT对PKC—β和Ang mRNA 表达有明显的抑制作用。由于Ang是Ang—Ⅱ的前体，故Ang也能间接反映肾脏Ang—Ⅱ的水平。MT对PKC—β和Ang(Ang-Ⅱ)表达的抑制作用，可间接降低p47phox亚基的表达和活性，抑制NADPH氧化酶的活性，减少ROS的产生，降低肾皮质内的氧化应激水平。

MT对NADPH亚基p22phox和p47phox的作用是不同的，对p22phox mRNA表达没有影响，对p47phox mRNA的表达则有显著的抑制作用。p47phox磷酸化后可活化NADPH氧化酶。因此，MT对p47phox的抑制可直接降低NADPH氧化酶的活化。

总之，本研究表明，MT可抑制PKC—β、Ang和 p47phox的表达，降低p47phox亚基对NADPH氧化酶的活化作用，减少肾脏R0S的产生。MT可通过抑制肾皮质内的氧化应激水平，对糖尿病大鼠的早期肾脏病变具有保护作用。

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