TAT-SOD清除穴位胞内超氧自由基治疗单纯性肥胖的研究

                                                 郭静科¹，陈跃²，袁彬²，刘树滔³，饶平凡¹

                            ¹ 中科院上海生命科学研究院-浙江工商大学食品营养科学联合研究中心，浙江杭   

                     州，310035

                            ² 福建中医药大学针灸学院，福建福州，350122

                            ³ 福州大学生物工程研究所，福建福州，350002

                     通讯作者：饶平凡教授，E-mail: pingfanrao@zjgsu.edu.cn

摘要

TAT-SOD是一种超氧化物歧化酶（SOD）与TAT肽融合的重组蛋白。我们无意中发现TAT-SOD作用穴位的效果类似于针灸。为了进一步研究上述发现，我们计划以治疗单纯性肥胖为平台，比较TAT-SOD涂抹穴位与针刺穴位之间的效果差异。实验周期为12周，共收集90名志愿者，并分为3组。各组受试者所采用的穴位相同，具体实施过程如下：针刺组的受试者接受传统的针刺疗法，受试者每周至医院接受3次针刺治疗；TAT-SOD组的受试者使用TAT-SOD涂抹穴位，所用乳膏添加TAT-SOD，浓度为5000 u/ml，每个穴位大致1 cm²范围涂抹0.1 ml，每天在家自涂3次；安慰机组的受试者所用乳膏不含TAT-SOD，其余过程与TAT-SOD组一致。结果表明，TAT-SOD组和针刺组的受试者体重明显减轻，治疗有效率分别是60.0%和76.7%，安慰剂组则无显著效果。这初步验证了TAT-SOD作用穴位的效果与针刺穴位相近，可以作为刺激穴位的一种新方法，也暗示了清除超氧自由基是针灸过程中未知而关键的作用。

关键词：超氧自由基；TAT-SOD；针灸；经络；单纯性肥胖

超氧自由基是胞内活性氧中重要的组成部分，常常作为胞内信号传导途径中的第二信使，用于激活促炎症反应，与调节蛋白多糖和胶原蛋白的降解过程^[1]。细胞利用多种抗氧化酶抵抗活性氧的破坏^[2]，这些酶有超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）。一旦胞内的抗氧化酶含量不足，特别是SOD的缺失，会导致活性氧过剩，造成细胞伤害、凋亡、坏死^[3]。

为了抵抗氧化损伤，可以补充各种外源性抗氧化酶。然而，这些抗氧化酶拥有共同的主要问题，既无法有效地被递送进细胞，无法有效地减轻胞内活性氧形成的伤害^[4]。为了克服这样的困境，可以利用目前已发现的若干个具有递送外源性蛋白进入活体细胞功能的蛋白转导结构域^{[3, 4]}。TAT是这些转导结构域中的一种，来自转录蛋白HIV-1反式激活因子衍生的11肽^[5]。与转导结构域融合重组表达后，目标蛋白就具备跨膜进入细胞发挥作用的功能^[4]。在我们前期的工作中，已经通过这种手段融合了TAT-绿色荧光蛋白（TAT-GFP），研究绿色荧光蛋白转导细胞的性质。结果证实融合蛋白能够有效转导多种哺乳动物细胞，如大鼠干细胞^[6]，人宫颈癌细胞HeLa^[7-9]，人肝癌细胞BEL-7402、SMMC-7721，人肝细胞L02^[8-9]，也能够通过涂抹皮肤的方式进入到大鼠真皮层，或者通过腹腔注射的方式进入小鼠心、肝和肾组织。此外，用融合蛋白喂食线虫发现蛋白分布于线虫消化管道及其原体腔^[10]。对于TAT-Cu,Zn 超氧化物歧化酶（TAT-SOD），已发现可以进入细胞内^[11-15]、甚至进一步进入产生超氧自由基的主要场所——线粒体内^[16]，这意味TAT-SOD具备成为一种理想的外源性胞内抗氧化酶的潜力。我们前期研究发现，TAT-SOD能够提高哺乳动物细胞在UV-C^[11]以及UV-B^[17]辐射下的存活率，同时发现TAT-SOD能够预防^[14]及保护^[15]UV-B单剂量辐射，或者重复辐射对豚鼠皮肤的伤害。

在局部抗氧化应用上，我们意外地发现在人体颈部穴位使用TAT-SOD，能够有效缓解咽喉肿痛，所产生的效果类似针刺穴位。从生物化学的角度分析，TAT-SOD的作用机理明了，它的唯一作用是进入细胞减少胞内超氧自由基的含量。因此我们有理由怀疑针刺穴位产生的作用是清除穴位部位的胞内自由基。过去对针刺穴位作用的解释尚未明确，但是TAT-SOD的作用明确，作用底物种类清晰。从TAT-SOD应用在穴位所产生的效果来说，我们怀疑针刺穴位类同于TAT-SOD作用穴位，以清除胞内超氧自由基为目的。区别是前一种依赖于物理造成微创伤导致后续一系列复杂反应，后者产生酶催化反应。在另一方面，我们前期通过尾静脉注射活性氧探针到活体SD大鼠体内，发现它的腹部肌层内侧上出现与经络走向重合的荧光信号^[18]，此现象重复多次出现，意味着超氧自由基与经络密切相关。

在这篇文章中，我们将介绍比较TAT-SOD作用穴位和针刺穴位治疗单纯性肥胖的研究工作。目前单纯性肥胖可称为一种普遍的、难治的、危害大的疾病^[19]。在日常临床实践中，特别是在中医实践中，已表明针灸能够有效治疗单纯性肥胖。可惜的是，针灸实验难以通过良好执行的临床对照实验，特别是双盲实验加以验证^[20]。其中最主要的原因是针刺治疗与药物递送不同，很难设计相应的安慰剂对照组，也间接导致针灸实验的结果难以被科学届接受，它的作用机制也难以被阐述清楚。但是从自由基角度来说，目前已证实肥胖与超氧自由基导致的氧化应激密切相关^[21]。鉴于上诉我们的发现，我们怀疑针灸所产生的效果是来源于它某种原因产生的抗氧化作用。如果清除胞内超氧自由基能够被证实是针灸所产生的生物化学反应作用，基于此，这不仅仅可以针对针灸开发出有效的安慰剂对照实验，而且可以从一个新的角度来明确超氧自由基在针灸机制中所扮演的角色。

材料与方法

TAT-SOD是将人Cu,Zn-超氧化物歧化酶与TAT肽融合，在大肠杆菌表达，过程简述如下：构建：插入表达载体pGEX-2T，构建编码TAT-SOD的核酸序列；转染：携带TAT-SOD序列的表达载体pGEX-2转染大肠杆菌细胞（BL21, DH5α）；表达：异丙基硫代半乳糖苷诱导大肠杆菌表达，再经过亲和色谱分离，最终获得电泳纯的TAT-SOD^[13]。TAT-SOD与乳霜基质混合，乳酸基质采用婴儿润肤霜（强生，中国上海），主要成分是水、丙二醇、肉豆蔻醇肉豆蔻酸酯、甘油硬脂酸酯、油酸、硬脂酸。TAT-SOD与乳霜混合后可保持良好的活性，在室温下保藏6个月活力仅下降5.6% ^[12]。

受试者为24-34岁的健康成年人，患有单纯性肥胖症（BMI体质指数 > 25）。实验在福建中医药大学附属医院开展，时间从2008年11月3日到2010年9月13日。受试者如果存在以下状况将被排除在实验计划之外：曾经或体检结果怀疑患有肾脏、肝脏、心血管疾病；怀孕及哺乳期的妇女；患有继发性肥胖；正在或过去6个月内曾经因为接受医疗或其他因素的影响而出现体重减轻或患有严重的器官病。

90名受试者被分为3组，接受12周的治疗。针刺组每周3次到医院接受针刺穴位治疗，穴位采用滑肉门穴、天枢穴、外陵穴、大横穴、石门穴、下脘穴（表1）。TAT-SOD组采用的穴位与针刺组一致，但不采用针刺穴位的方法，使用0.1 ml含有5000 u/ml SOD的乳霜涂抹在穴位 1cm² 区域上，每天3次。安慰剂组采用的是不含TAT-SOD的乳霜取代，其余流程与TAT-SOD组一致。

表1  采用的穴位及定位

实验过程中并不控制饮食。体征测量项目有体重、体质指数、腰围、臀围和腰臀比。如表2所示，疗效被分为无效（体质指数减少值小于2），有效（体质指数减少值介于2与4之间）和显效（体质指数减少值大于4）。

数据以平均值（标准差）格式表示。所有数据处理通过微软Exce 2003软件处理。TAT-SOD组与针灸组数据经两样本t检验。

结果

基线评估、体征变化如表2所示。实验过程无受试者中途脱离或产生副作用。

表2  针灸组、TAT-SOD组合安慰剂组受试者的体征，平均值（标准差）

在实验过程中，TAT-SOD组和针灸组的受试者普遍反映胃口不好，意味着两种方式同样能起到抑制食欲的作用。

TAT-SOD组和针灸组分别体重减少了4.5 kg和5.1 kg，体质指数减少了1.8和2.1，腰围缩短了3.7cm和5.2cm，臀围缩短了2.5cm和3.6cm，腰臀比减少了0.01和0.02。安慰剂组没有明显的变化。

TAT-SOD组和针灸组受试者的肥胖程度降低，有效率分别是60.0%（18/30）和76.7%（23/30）。安慰剂组无显著效果。

讨论

也许是因为此次实验中的受试者年龄普遍较轻，体重减轻的程度比已报道的文献结果大^[22]。过去有关针灸治疗单纯性肥胖的实验中，结果往往因为针刺实验的特殊性，难以深入分析产生的生理机制，也常被在严格的科学评价下质疑。与之相比，我们采用分子结构已知、作用机理明确、专一性强的酶进行实验，方便进行安慰剂对照及双盲实验，有助于用更科学的手段研究经络的物质基础及针灸的作用机理。

此次实验初步地探究TAT-SOD对穴位作用的效果，所用的浓度、使用方式尚未明确等，所产生的效果因此略弱于针灸的效果（见表2）。这些问题有待进一步研究解决。

在更进一步深入研究TAT-SOD对穴位的作用之前，此次实验的发现有助于解释针灸的机理，为医学研究和医学应用提供了一个新的思路，可以尝试用胞内超氧自由基清除剂取代复杂而又难以解释的针灸过程。与承受复杂的针刺穴位疗法相比，患者更容易接收像涂抹乳霜一样地使用TAT-SOD。

已有文献报道^[23]，针灸或者电针的过程，会导致患者中枢神经系统分泌特殊的神经肽，如神经肽Y（NPY），以抑制食欲^[24]。同样，在此次研究中，接收针灸与接收TAT-SOD的患者普遍反映食欲降低，这暗示着TAT-SOD与针灸同样会抑制受试者的食欲，造成体重减少的结果。但是，针灸诱导神经肽Y的分泌，目前仅有文章报道有关结果的发现，但对于机理尚未解释清楚。

与针刺相比，利用功能专一的抗氧化酶TAT-SOD，有利于解释其中的机理。TAT-SOD作用在穴位上，所起到的效果仅能清除穴位部位的胞内超氧自由基。而已有文章报道，下丘脑的SOD mRNA水平提高，会引起NPY mRNA水平的变化^[25]，并且下丘脑的氧化应激程度与神经肽Y的分泌密切相关^[26]。因此我们怀疑TAT-SOD影响了穴位的氧化应激水平，与穴位远端对应的靶标器官的氧化应激水平密切相关，体现在食欲的抑制现象上。而在穴位与靶标器官这两者之间的联系通路，超氧自由基扮演了非常重要的角色。

在中医理论中，经络是联系脏腑和穴位的重要途径。在我们前期的工作中，通过对大鼠注射活性氧标记物——二氯二氢荧光素二乙酯，显示出与经络走向重合的线状荧光分布^[18]。这强烈地揭示经络系统，所谓的气的通路，有可能是传导超氧自由基的通道。在穴位采用TAT-SOD，获得针灸类似的结果，为说明前面的假设又前进了一步，也初步地解释了穴位氧化应激程度能够通过经络影响到下丘脑的氧化应激程度，从而产生抑制食欲的现象（如图1所示）。就此，我们认为，胃经上的滑肉门穴、天枢穴、外陵穴的氧化应激水平，会通过经络影响到通条经络上，又处于脑部发迹边的头维穴。虽然尚不知道头部的穴位是如何作用到颅腔内的大脑组织，但是我们可以从中医理论假设胃经进入到脑部影响到下丘脑。证实经络是管理、传导、处理超氧自由基的系统需要非常巨量的工作，我们可以从假设出发，再加以一步一步地精细研究、验证。在这过程中，任何一个细微的发现，都有助于解释针灸的本质，开发新的疗法，甚至对整个经络理论，以及发现一个从未认知的生理系统有所贡献。

图1  穴位氧化应激水平影响分泌神经肽Y的示意图。

O₂˙^-，超氧自由基；NPY，神经肽Y；ST8，头维穴；ST24，滑肉门穴；ST25，天枢穴；ST26，外陵穴

结论

在这篇文章中，我们叙述了用TAT-SOD涂抹穴位治疗单纯性肥胖的实验，结果显示疗效显著，接近针灸疗法。TAT-SOD治疗方法在未来可以作为针灸疗法的备选项，并且通过TAT-SOD疗法，可以帮助推进针灸机理的研究工作。

致谢与参考文献部分-略

(注：本文为作者在国外杂志上已发表的英文内容，现以中文刊登介绍这一研究内容和成果，-编委)